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      抗白色念珠菌感染中納米技術的作用及運用

      來源:生命的化學 作者:郎晨瑜,王曉芳,王新,
      發布于:2021-03-09 共10849字

        摘    要: 白色念珠菌(Candida albicans, C. albicans)在引發血源性感染的病原微生物中位列第四,全國每年由C. albicans引起的各類感染性疾病高達千萬例。該菌極易附著于植入醫療器械的表面,形成堅固生物被膜阻礙藥物和免疫系統的進攻,給治療帶來了極大難度。同時,近年來C. albicans的高流行率和不斷增強的耐藥性使C. albicans的治療面臨更大的挑戰。納米材料因其具有低毒性、尺寸效應、良好的抑菌性,以及促進光動力抗菌作用等功效被廣泛應用于抗感染治療。本文綜述了近年來納米技術在C. albicans預防、診斷和治療中應用的研究進展,并探討其作用機制,為納米技術抗C. albicans感染的進一步研究提供參考。

        關鍵詞: 納米技術; 白色念珠菌; 抗感染; 應用;

        Abstract: Candida albicans(C. albicans) is the fourth most common pathogenic microorganism that causes blood-borne infections, and 10 millions of various infectious diseases are caused by C. albicans in China every year. However, C. albicans can easily attach to the surface of implantable medical device and form a strong biofilm that resists the effects of drugs and the immune system, so it is extremely difficult to be killed. At the same time, the treatment of C. albicans also face a huge challenge due to its high prevalence rate and increasing resistance. Nanomaterials are widely used in the antibacterial field because of their lower toxicity, size effect, good antibacterial properties and enhancement to photodynamic antimicrobial chemotherapy. In this paper, we summarized the advance and possible mechanism of nanotechnology in the prevention, diagnosis and treatment of C. albicans, providing a reference for the further research of nanotechnology against C. albicans.

        Keyword: nanotechnology; Candida albicans; antibacterial effects; application;
       

      抗白色念珠菌感染中納米技術的作用及運用
       

        白色念珠菌(Candida albicans,C.albicans)又叫白假絲酵母菌,是一種黏附寄生于人體口腔、陰道、胃腸道等黏膜及皮膚的常見真菌[1],同時又是一種條件致病菌,某些因素(如p H改變、機體免疫功能下降、廣譜抗生素和激素使用過度)會使正常菌落所處環境平衡被打破,C.albicans可迅速增殖,并轉化為有強致病能力的菌絲體形態,侵入黏膜和組織深層或進入血液循環系統,引發淺表性、深部或系統性的C.albicans感染[2]。在全球范圍內,念珠菌引發的感染病癥每年約4 000萬例,其中C.albicans是最常見也最致命的,約占念珠菌感染病例的50%~70%,總死亡率為43%[3,4]。隨著廣譜抗生素的濫用,以及癌癥、糖尿病、艾滋病等使人免疫能力低下病癥的盛行,C.albicans感染發病率逐年增加,并且深部C.albicans感染成為免疫抑制宿主死亡的主要原因之一[3]。此外,C.albicans常黏附于植入體內的醫療器械如導管、支架、起搏器、人工心臟瓣膜和膝蓋、義齒等的表面,由生物醫學設備周圍的體液給菌體提供營養,并形成生物被膜[5]。然而,生物被膜不僅能降低C.albicans對藥物的敏感性,使其對抗真菌藥的抵御能力提高10~1 000倍,還可增強菌體在宿主免疫系統攻擊下的存活能力[6]。目前藥物治療仍然是抗C.albicans感染的主要手段,但是傳統抗真菌藥物種類很少,常用藥物僅有唑類、多烯類及棘白菌素類等,且其肝腎毒副作用強、價格昂貴,大多對生物被膜的作用有限,其廣泛應用和無選擇性的使用更是導致眾多耐藥菌株的產生[7]。因此,迫切需要研究出新的抵抗C.albicans的治療策略。

        納米顆粒因其尺寸微小和比表面積較大,更易透過生物膜與真菌相互作用,近年來被廣泛應用于抗真菌研究[8,9,10]。與傳統抗菌劑相比,以納米銀(silver nanoparticles,Ag NPs)為代表的一些金屬納米粒子不僅具有良好的抗菌活性,而且其抗菌譜更廣、抗菌更持久、化學性能更穩定,不易產生耐藥性[11]。因而大量科研人員將納米技術引入C.albicans的診治中,期望借助納米技術降低C.albicans的感染機率,改善其耐藥性,增加藥物的療效和安全性,為設計新型抗真菌藥物提供方向。

        1、 納米技術在預防C.albicans感染中的應用

        “不治已病治未病”是中國最早的醫學典籍《黃帝內經》中提出的觀點,也是中醫藥的精髓理論。西醫則稱之為第一級預防亦稱病因預防,即在疾病發生之前,針對健康影響因素采取措施,防止或減少疾病發生。疫苗是預防C.albicans感染的重要策略之一,近年來有眾多學者對其進行了研究。

        1.1、 在研制疫苗方面的應用

        常見的真菌疫苗有全菌疫苗、蛋白疫苗、糖結合疫苗及核酸疫苗等,但大多數仍停留在實驗室階段,目前還沒有被允許投入臨床使用的真菌疫苗[12],所以對C.albicans疫苗的研制仍是現階段的重要任務。Carneiro等[13]采用單油酸甘油酯作為穩定劑制備了雙十八烷基二甲基溴化銨脂質體,作為C.albicans細胞壁蛋白的載體,該脂質體制劑性質穩定,無細胞毒性,可被巨噬細胞攝取。該研究進一步發現,制備的納米脂質體顯示出良好的佐劑活性,可誘導免疫小鼠表現出強烈的體液免疫應答和細胞免疫應答。與僅使用細胞壁蛋白單獨免疫的小鼠相比,該系統可誘導高水平的白介素-17和干擾素-γ,說明該納米脂質體對輔助型T細胞介導的免疫應答有極化作用,從而確認其具有免疫佐劑的潛力。關麗影[14]將殼聚糖(chitosan,CS)與C.albicans熱休克蛋白90重組質粒制備成CS-核酸疫苗納米粒,經皮下兩點注射的方式免疫小鼠,發現制成的CS納米粒子不僅能夠幫助重組質粒抵御酶解,還可使免疫小鼠產生抗重組蛋白的特異性抗體,同時對核酸疫苗還起到了明顯的緩釋作用。盡管這方面研究不是很多,但免疫效果比較明顯,因此,為預防C.albicans或其它真菌感染提供了新的思路。

        1.2、 在預防植入性生物材料被C.albicans污染中應用

        C.albicans是人口腔中的常見共生真菌,非常容易黏附于植入材料如義齒或導管表面,并在其上形成生物膜,這是C.albicans感染的常見途徑之一。然而,一旦形成生物膜,C.albicans對抗機體免疫力及抗真菌藥物的能力就會大大增強,從而導致機體反復感染。臨床上常用手術刮除或藥物治療等手段除去植入性醫學生物材料表面的生物膜,但這些方法受花費高、毒性強、療程長和耐藥性等限制[2]。因此,對常用的植入材料進行改良來抑制病原菌黏附和菌膜形成是預防C.albicans感染的有效策略之一。常見的改良方式有兩種。(1)材料中摻雜不同物質。如Li等[15]探索了在丙烯酸樹脂基托材料中加入Ag NPs之后對C.albicans的抵御作用,結果表明加入Ag NPs后不僅可以通過Ag NPs本身的抗真菌作用抑制生物被膜的產生,銀離子濃度達到5%時還能抑制C.albicans的黏附。Lee等[16]發現,氧化石墨烯納米片的添加可提高義齒材料聚甲基丙烯酸甲酯對C.albicans的抗黏附效果。其作用機制主要基于氧化石墨烯提供的大量羥基和羧基基團能夠增加聚甲基丙烯酸甲酯的親水性,有助于在其表面形成致密的水合層,對于防止微生物黏附起到物理屏障作用。(2)改良材料表面性質。如李斌等[17]考察了在義齒基托表面鍍用納米非晶金剛石薄膜的抗C.albicans黏附作用效果,發現金剛石膜能夠通過提高義齒表面光潔度來減少C.albicans在其表面的黏附,其耐腐蝕和膜基結合力強等特性還能保證長期抑菌,為開發減少真菌黏附的義齒材料提供了新的思路。此外,Beltrán-Partida等[18]發現,用超氧水消毒鈦合金-Ti O2納米管制備的牙科材料抗C.albicans黏附作用可持續24 h,同時可抑制生物膜形成和定植。作用機制主要是破壞真菌-材料界面處的黏附點,進而減少真菌定植。

        2、 納米技術在抗C.albicans診斷中的應用

        “早發現、早診斷、早治療”被列為第二級預防亦稱臨床前期預防,可逆轉、停止或延緩病變的發展,是提高患者生存率和生活質量的關鍵因素。第二級預防對于C.albicans感染的治療尤為重要,一旦C.albicans侵入血液,并進入器官當中,再進行治療就非常困難,死亡率極高。因此,早確診、早治療是C.albicans抗感染的最佳選擇。

        目前,檢測C.albicans感染的常用方法主要有血培養法、分子生物學法、直接鏡檢法等。其中,血培養法被認為是臨床上真菌感染診斷的金標準,但是敏感性差且培養時間較長,容易錯過最佳治療時間。其他方法也存在價格昂貴、重現性較低等缺點,難以滿足臨床診治需求[2]。因此,對早期診斷新方法的開發刻不容緩。Tian等[9]將刀豆蛋白A與超順磁性納米顆粒作用得到表面荷電的磁性納米粒子,利用帶正電的納米粒與C.albicans細胞壁的甘露聚糖產生特異性結合及強靜電作用來捕獲C.albicans。研究發現,在102~107 cfu/m L的初始酵母濃度范圍內,磁性納米顆粒均表現出良好的酵母分離效率[9]。然后,采用熒光素-刀豆蛋白A熒光染色和T2磁共振分析對捕獲的C.albicans進行檢測。Misiak等[19]制備了Yb3+和Tm3+共摻雜Ca F2納米顆粒,并用蛋白質G對其表面修飾。采用蛋白質G功能化上轉換納米晶對C.albicans進行標記和成像,表現出良好的信噪比和較高的特異性。此外,東北師范大學王麗課題組首次利用噬菌體文庫對氧化鐵納米顆粒進行篩選,他們分別將單一多肽及結合在抗分泌型天冬氨酰蛋白酶2(secreted aspartyl proteinase 2,Sap2)抗體上的多肽展示在不同噬菌體展示系統上,與氧化鐵納米顆粒孵育后,制備了一種雙展示噬菌體磁性納米纖維[2,20]。Sap2抗體是臨床輔助診斷C.albicans感染的重要檢測標志物,一般在感染的初期就會產生。將上述磁性納米纖維用于Sap2抗體的檢測研究發現,該檢測方法的最低檢測限為1.1 pg/m L,大大提高了常規抗原Sap2檢測方法的靈敏度,約降低了2個數量級。上述研究說明,納米技術的引入不僅可以使C.albicans的檢測方法多樣化,且更加靈敏和精準,值得進一步深入開發和利用。

        3 、納米技術在抗C.albicans治療中的應用

        3.1 、納米顆粒在抗C.albicans治療中的應用

        隨著抗真菌藥物越來越多地應用于臨床,真菌耐藥性問題日益突出,其中C.albicans的耐藥率也在逐年上升,甚至出現了多重耐藥菌。如何減少真菌的耐藥性、什么樣結構的藥物既能有效抗真菌又對機體沒有更大毒性?這是醫藥科技工作者迫切需要解決的難題。為此,有研究人員開發出了噬菌體、細胞壁水解酶和抗菌肽等一些新型的抗生素替代品,同時也有科研團隊關注納米材料在疾病治療中的作用。Priyadarshini等[21]將碳點(carbon dots,CDs)覆蓋在金納米顆粒(gold nanoparticle,GNP)表面形成一種納米共軛結構,并比較了五種不同粒徑的Au@CDs納米粒子對C.albicans的抑制效果。結果表明,納米粒對C.albicans的毒性主要源于CDs的高毒性,并且納米粒子的粒徑越小、比表面積越大,致使更多的CDs滲透到菌體中通過產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)殺傷真菌。Wani等[22]采用超聲化學方法制備出粒徑約2 5 n m的金納米盤和粒徑約為3 0 n m的多面體GNP,并比較了兩種GNP對C.albicans的抑制效果。結果顯示,兩種納米粒均有抑菌活性,但金納米盤比多面體GNP具有更好的抑制作用。分析其機理,可能是GNP直接與質膜H+-三磷酸腺苷酶相互作用,使質子泵活性降低,導致C.albicans無法吸收養分供其正常生長。與多面體GNP相比,具有更小粒徑的金納米盤擁有更大的比表面積,與細胞膜上蛋白結合位點之間的作用更強,且更易透過質膜進入真菌內部發揮金的毒性作用,該研究為提高抗真菌藥物療效提供了全新的思路。

        此外,據報道,CS、銀、硒及氧化鋅等納米粒對C.albicans均有不同程度的抑制作用。其中,納米硒由于其低表面能和帶負電等特性使其極易黏附在菌體表面,滲入菌體內并通過收縮折疊細胞膜改變其形態,殺傷病菌[23];氧化鋅納米粒和Ag NPs則均能使C.albicans體系中生成更多ROS,促進殺菌效果[24,25]。進一步研究發現,納米CS對變形鏈球菌和C.albicans雙菌種構成的生物膜總能量及兩菌細胞活力均有明顯的抑制作用,且存在濃度依賴性[26]。此外,Randhawa等[5]發現,粒徑為5~20 nm的兩性霉素B、酮康唑和百里香醌顆粒對C.albicans及其生物膜的抑制效果是微米級藥物的2~4倍,分析原因可能是納米級藥物由于其尺寸微小更易進入細胞體內;并且,相同粒徑條件下,上述藥物對C.albicans的抗菌活性是其生物膜的8~10倍。

        3.2、 納米載體在抗C.albicans治療中的應用

        近年來,隨著納米技術的蓬勃發展,人們逐漸認識到納米材料作為藥物載體具有多種優勢,如增加藥物穩定性、改善其溶解行為、促進藥物在體內轉運、靶向分布等,進而增強藥物療效甚至實現多功能化治療[27]。因此,有大量研究人員將載藥納米材料用于抗C.albicans感染的研究。

        眾所周知,巨噬細胞是人體固有免疫的重要組成部分,通過識別、吞噬和處理抗原等作用來降低感染發生的可能性,是抵御外來病原菌的第一道防線。山東大學藥學院姜新義團隊提出一個對抗C.albicans感染的新思路,即通過調控巨噬細胞分化的免疫策略來抵抗系統性C.albicans感染[28]。他們報道了一種可生物降解的納米三元復合物——甘露糖修飾的CS負載伊馬替尼,研究表明,該甘露糖化納米復合物能夠提高巨噬細胞表面M1型受體CD80的比例,增加腫瘤壞死因子-α、白介素-6以及誘導型一氧化氮合酶的表達,促進體外實驗中巨噬細胞對C.albicans的吞噬能力。同時,在體實驗證明,該納米復合物可利用巨噬細胞再分化的調節途徑來指導其原位重塑,使小鼠脾臟C.albicans載量顯著降低,脾臟中M1型巨噬細胞比例明顯提高,從而增強機體抗C.albicans感染的能力,該研究成果為治療病原微生物感染提供了新的免疫調控研究思路。此外,有科研人員分別采用絲素蛋白、p H響應膠束體系及乳化給藥系統[29,30,31]作為藥物載體,考察了載體在藥物抑制C.albicans方面是否有促進作用。結果非常令人興奮,載體不僅能有效地遞送伊曲康唑、改善藥物釋放,而且能夠抑制菌絲的產生,干擾菌膜的形成[29]。此外,姜黃素-絲素蛋白納米粒能夠減少C.albicans黏附在細胞表面,抑制生物膜產生,與姜黃素相比具有更高的水溶性和抗菌活性[30]。

        臨床研究發現,C.albicans往往與一種甚至多種微生物在醫療器械表面形成雙菌種或多菌種抗性更強的生物膜,為其治療帶來更大困難[6]。因此,探索新的抗多菌種生物膜的藥物或治療手段迫在眉睫。Monteiro課題組將氯己定負載在CS功能化氧化鐵納米粒(iron oxide nanoparticles,IONPs)上,得到IONPs-CS-氯己定納米系統,并考察了該納米系統對C.albicans和變形鏈球菌共感染形成的雙物種生物膜的抑制作用[32]。結果表明,IONPs-CS-氯己定的存在可以使雙物種菌落數減少4.27 log10。然而,作用于已形成的雙物種生物膜時,效果略有下降,使菌落數減少了3.25 log10。此外,Monteiro課題組還將CS功能化的IONPs作為咪康唑的載體,考察其對C.albicans和光滑念珠菌雙菌種生物膜的抑制效果[33]。研究結果證實,IONPs-CS-咪康唑與單獨咪康唑相比,在降低生物膜代謝活性和細胞活力方面表現出更強的作用效果,可降低生物膜代謝活性93.04%~94.40%,C.albicans菌落數減少1.85~2.05log10,但對生物膜的總生物量和細胞外基質成分無顯著影響。

        3.3 、納米技術輔助光動力抗菌化學療法在抑制C.albicans感染中的應用

        光動力抗菌化學療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy,PACT)是近年來新興的一種抗菌方法,該方法主要是借助特定波長的光照射聚集在病灶區的光敏劑時,可激活光敏劑產生單線態氧等ROS,同時可誘發一系列聲化學反應及物理作用,達到殺傷微生物的目的[26,34]。該技術不易誘發耐藥菌的產生,因此近年來有科研人員將其用于抗C.albicans的感染中,并取得了較好的作用效果。

        Yang等[35]將二氫卟吩e6封裝在溴化十六烷三甲基銨(cetyltrimethyl ammo-nium bromide,CTAB)制備的脂質體中,考察其介導的PACT在抑制C.albicans上的效果。實驗結果證實,脂質與二氫卟吩e6的摩爾比越低、脂質體粒徑越小及脂質體中CTAB的濃度越高,負載二氫卟吩e6的CTAB-脂質體對C.albicans的敏感株和耐藥株可展示出更強的光動力抗菌效果。Khan等[36]考察了GNP對于亞甲藍(methylene blue,MB)介導的PACT在對抗頑固性C.albicans生物膜過程中的增強作用,實驗結果證實,GNP可以明顯促進MB介導的PACT作用,使C.albicans生物膜抑制率從單獨使用MB時的81.9%提高到95.4%。Sherwani等[37]則考察了在C.albicans感染的雌性巴比賽小鼠體內,GNP對于MB和甲苯胺藍(toluidine blue,TB)介導PACT的促進作用。研究結果表明,不論是無光照GNP-MB和GNP-TB組,還是GNP-MB和GNP-TB介導的PACT組均可以減少生物膜的形成,并且發現GNP與MB和TB之間具有明顯的協同作用。進一步的實驗數據顯示,PACT實驗組可將生物膜抑制率從單獨使用G N P-M B或G N P-T B組的4 0%~5 0%提高到接近80%,充分說明GNP能夠明顯提高PACT在抗生物膜方面的作用。

        4 、納米技術抗C.albicans作用機制研究

        納米材料抗C.albicans的機制比較復雜,主要可概括為以下幾方面:(1)納米粒子具有較大的比表面積,可增強其與C.albicans的相互作用,而極小的尺寸促使其更易滲透到細胞內發揮作用[5,8];(2)通過改變細胞膜的流動性和完整性,或者使胞內微環境改變,從而影響其物質轉運等正常功能[10];(3)借助某些因素(如光照)產生羥基自由基、超氧負離子等ROS,利用ROS引起系列氧化應激反應,使微生物內有機組成成分的化學鍵斷裂,對DNA等生物分子造成嚴重的氧化損傷。此外,還有研究表明ROS可通過激活鈣離子流從而破壞鈣離子通道的正常功能,影響正常信號傳導,從而達到殺菌效果[10,31];(4)影響生物膜相關基因的表達,GNP對C.albicans細胞膜上兩種重要基因均有明顯抑制作用;(5)金屬離子溶出機制[32,38],金、銀、鋅等重金屬離子可與帶負電的細胞膜靜電吸附,進而擴散入菌體內與酶蛋白或核酸上的硫或磷相互作用,使酶失活或DNA結構改變;(6)納米粒子直接與質膜上一些重要的蛋白質相互作用使蛋白質變性,導致質子泵的正常功能受到干擾從而發揮殺菌作用[22,39];(7)利用納米材料特性增強抗菌性或者改變材料表面性質,進而抑制C.albicans在植入性醫學生物材料表面的吸附或定植。

        5 、展望

        近年來,C.albicans感染逐年增加的發病率和不斷增強的耐藥性使其預防與治療幾乎成為全球性的難題,引起了國內外學者的廣泛關注,針對C.albicans感染的相關研究和文獻也不斷涌現。將納米技術引入抗C.albicans感染不僅能減緩真菌耐藥性,還能增強抑菌效果與靶向性。有些納米材料不僅對病原菌構成的生物膜有很好的抑菌作用,還能有效抑制生物被膜的形成。此外,針對近年來出現的多菌種生物膜抗感染研究也取得了一定進展。但目前納米技術應用于抗C.albicans感染的研究仍處于初級階段,針對生物效應的機制方面研究較少,納米材料的抑菌機制和作用靶點仍不十分明確,納米制劑靶向治療方面的研究更是薄弱,因此,系統地對納米材料或納米載體促進抗C.albicans的效果機制進行探討將成為一個具有突破性的研究方向,而真菌基因組學技術可能是幫助人們深入理解作用機制的另一個重要突破點。此外,納米技術想要在抗C.albicans感染臨床應用中推廣開來,仍然面臨著體內不可控、未知的毒性和不良反應等難題,需要大量的動物實驗和臨床研究做補充。因此,在今后的研究中,需要更深入地關注納米材料應用于抗C.albicans感染的抑菌機制、耐藥機制、體內代謝和藥物毒性等,從而為納米制劑更高效、安全地應用于真菌感染臨床治療中奠定基礎。

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      作者單位:遼寧大學藥學院
      原文出處:郎晨瑜,王曉芳,王新,張偉豪,梁琪曼,胡自強,龍碧,劉彬,徐亮.納米技術在抗白色念珠菌感染中的應用[J].生命的化學,2021,41(02):325-331.
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